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工业技术论文

虾夷马粪海胆生殖腺多糖形成多聚体现象

摘要在提取海胆生殖腺多糖过程中发现提取产物存在多糖聚合现象。为揭示多糖聚合原因,以Sephadex G-75对多糖进行纯化,将得到的海胆生殖腺多糖SUGP进行高效液相色谱法分析。实验结果表明:SUGP在氯化钠盐溶液存在的情况下在液相色谱图中出现单一峰,为纯度良好多糖;但在去除氯化钠盐离子后,SUGP在液相色谱图中出现两个分子量大小不同的检测峰。分子量检测结果表明SUGP单体的分子量为4436Da。PMP柱前衍生化高效液相色谱法分析SUGP单糖组成表明,SUGP单糖组成为甘露糖、葡萄糖和氨基葡萄糖。                                      关键词海胆生殖腺;多糖;多聚体                             中图分类号:TS254.9            文献标志码:A

Formation polymer phenomenon research of polysaccharide from gonad of sea urchin                                            

LI Peng-fei,CAO Yue-gang,YANG Jing-feng                                  (School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China)        

Abstract: Polysaccharide extracted from gonad of sea urchin were found to have aggregation phenomena during the purification processing. To reveal this phenomenon, the polysaccharides were purified with a column of Sephadex G-75. The product of SUGP was analysis by High Performance Liquid Chromatography. The result showed that SUGP appears a single peak in the solution of sodium chloride. However, SUGP appears several peaks with different molecular weight when sodium chloride were removal from the solution. The molecular weight of monomer SUGP was determined to be 4436Da. SUGP contained of mannose、glucose and amino glucose analyzed by PMP derivatization method.

Key words: sea urchin gonad; polysaccharide; aggregate


0 引言


海胆(Hemicentrotus pulcherrimus)属于棘皮动物门海胆纲,海胆主要由体壁、内脏、内含物、生殖腺和内脏构成 [1]。研究表明,海胆的生殖腺含有大量的蛋白质、氨基酸、高度不饱和脂肪酸、糖类和其他生理活性物质 [2]。目前对海胆的活性物质研究主要集中于海胆蛋白、海胆多糖、海胆油脂、色素、毒素等方面[3,4-7]。目前关于海胆多糖研究一般集中于抗肿瘤和增强机体免疫力等生理功能方面[8,9],还没有关于虾夷马粪海胆生殖腺多糖形成多聚体的研究报道。关于其他多糖聚合方面的研究报道,王小梅 [10]等研究提取过程中麦冬多糖结构及聚集行为的变化情况,通过原子力显微镜观察到多糖单分子链形态和明显的螺旋结构,表明溶液浓度及超声处理可能对麦冬多糖的分子间及分子内氢键产生影响,导致多糖分子结构发生变化,进而影响多糖发生聚集与解聚。曹宁宁[11]等研究了疏水性多糖在水中的自聚集行为,发现胆固醇修饰的葡聚糖在水溶液中浓度较低时是以分子为单位分散,当浓度增加时,分子上胆固醇开始自聚集形成胶束状的聚集体,自聚集体能与疏水性物质相结合,其结合力源于疏水作用力。李晓钡[12]研究了阿拉伯半乳聚糖蛋白分子的自聚集行为,发现熟化过程使阿拉伯胶中的分子之间发生相互作用,阿拉伯胶属于杂多糖,含有蛋白质和多糖等成分,熟化等过程会促进多糖-蛋白质的交联反应,形成两亲性的多糖-蛋白质聚集体。李岱[13]等研究不同环境下酸性柴胡多糖的多种聚集形态,发现水溶液中酸性柴胡多糖分子呈现旋绕状态的柔性链,但盐离子在一定程度上控制着多糖分子构象的变化,在溶液中无机盐离子的屏蔽作用下单分子糖链之间通过氢键相互作用缔合成胶态分子股,随着无机盐离子浓度的增大 ,分子内的相互作用也随之改变。

多糖、蛋白会发生聚集现象,不同环境会对多糖分子、蛋白质间的离子键或氢键以及分子间作用力产生影响,会改变多糖、蛋白的聚集形态,聚集现象给功能产品研发、生产等方面带来影响,所以本实验以虾夷马粪海胆生殖腺为原料,分离纯化生殖腺多糖,研究虾夷马粪海胆生殖腺多糖形成多聚体的现象,为其功能产品的开发研究提供支持。


1材料与方法


1.1材料与试剂

新鲜虾夷马粪海胆  购自大连长兴水产市场;木瓜蛋白酶等生化试剂  生工生物工程上海股份有限公司;甘露糖等生化试剂  Sigma公司;乙醇、苯酚、氯仿、丙酮、浓硫酸等均为分析纯。

1.2仪器与设备

高效液相色谱仪(配有ELSD 2000ES型蒸发光检测器) 日本岛津;UV-2100紫外可见分光光度计 尤尼柯上海仪器公司;JJ200Y型精密电子天平 美国双杰兄弟(集团)有限公司;PHS-3C精密pH计 上海雷磁仪器厂。

1.3实验方法

1.3.1 虾夷马粪海胆生殖腺粗多糖的提取、纯化

新鲜虾夷马粪海胆去壳、清洗后冷冻干燥,粉碎机粉碎后加入丙酮脱脂。加入2.5%质量分数的木瓜蛋白酶酶解,离心合并上清,加入3倍体积乙醇,4℃醇沉12 h,离心取沉淀,冷冻干燥后再经过Sevag法脱蛋白[14]得到虾夷马粪海胆性腺粗多糖。采用Sephadex G-75对虾夷马粪海胆生殖腺粗多糖分离纯化。相同组分多糖洗脱液经合并、透析、冻干得多糖组分,将最终纯化得到的多糖命名为SUGP。

1.3.2 SUGP的纯度鉴定

1.3.2.1凝胶柱层析方法

取2mg SUGP,溶解于1mL去离子水中,样品的浓度为2mg/mL,以Sepharose CL-6B凝胶色谱检测纯度。同时制作不同分子量标准葡聚糖线性回归方程,测定SUGP分子量。

1.3.2.2凝胶高效液相色谱法

取1mg SUGP溶解1mL超纯水中,使其充分溶解,膜过虑后,以HPLC法分析所提取多糖纯度。色谱条件:TSK-GEL G-4000PWXL柱(7.8mm×300mm),流动相为超纯水,流速为0.2mL/min;检测器: ELSD 2000ES型蒸发光检测器,漂移管温度80℃;载气为N2,流速为2.0 L/min。

1.3.3 PMP柱前衍生化高效液相色谱法分析SUGP单糖组成[15]

多糖的水解:准确称取4 mg SUGP溶于1 mL 2 mol/L的三氟乙酸中,充N2密封,在121 ℃的条件下水解2 h,取出后加无水甲醇,N2吹干,作为SUGP水解物备用。

衍生化标记:分别称取甘露糖、葡萄糖、氨基葡萄糖及半乳糖各0.0018g,鼠李糖及岩藻糖各0.0016g,木糖及阿拉伯糖各0.0015g,葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸各0.0019g,混合作为混合标准单糖备用。将


SUGP水解物、10种标准单糖(各10 mg)和混合标准单糖,溶于5 mL氨水中,取该溶液500 μL与500 μL的PMP/甲醇溶液(0.5 mol/L)混合,在70℃下反应30 min。取出后冷却至室温,加入1.5 mL纯水,真空干燥,重复2次。干燥后的物质用1mL纯水及1mL氯仿溶解,充分振荡后除去有机相,重复3次,静置30 min,取上清液进 行HPLC分析。

色谱条件:色谱柱Tigerkin C18柱(4.6mm×250mm,5μm);流动相0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(Na2HPO4-NaH2PO4,pH 6.7)-乙腈(83:17),流速1mL/min;检测波长254 nm;柱温30 ℃;标准品进样体积5μL,样品进样体积5μL。

2 结果与讨论

2.1 虾夷马粪海胆生殖腺粗多糖分离纯化

以虾夷马粪海胆生殖腺为材料提取海胆多糖,经分离提取、脱蛋白、脱糖原处理后,以凝胶层析法对海胆多糖进行分离,采用Sephadex G-75层析柱纯化海胆多糖,纯化结果见图1。

图1 粗多糖在Sephadex G-75柱的洗脱曲线

Fig.1 Chromatogram of Polysaccharides on                                                                                                   Sephadex G-75 column

由图1可知海胆多糖经Sephadex G-75分离后可得两个组分,其中组分1的多糖含量较少,而组分2则含量较多,为海胆多糖的主要组成成分。将峰Ⅱ组分进行分离合并透析冻干后得到均一的海胆多糖SUGP。

2.2 SUGP的纯度鉴定

采用Sepharose CL-6B对收集到的峰ⅡSUGP进行纯度鉴定结果如图2所示。实验结果表明,除主要糖峰出现在第65到81管之间外,在第20到30管附件又出现较明显的糖峰。这一结果表明SUGP可能为分子量大小不同的多糖混合物。但经过反复多次的凝胶层析法纯化海胆多糖,以分子量不同截取多糖组分后,所得多糖仍呈现出分子量大小不同组分的混合状态。因此,怀疑第一峰的大分子量多糖可能为第二峰小分子量多糖的聚合体。

= 1 \* ROMAN I

 

= 2 \* ROMAN II

 

Fig.2 Sepharose CL-6B elution of SUGP

采用凝胶色谱HPLC分析收集的峰ⅡSUGP(见图3)。将截留得到的小分子量多糖SUGP经透析冻干处理后脱除了氯化钠组分,再经HPLC分析,分析结果与Sepharose CL-6B纯度鉴定结果相似,仍然没有出现单一峰。

图3 HPLC鉴定SUGP纯度

     Fig.3 HPLC elution of SUGP

2.3 SUGP的聚合检测

 

 
为证实以上猜测的合理性,我们采用高效液相凝胶层析法分别对图2中出现的两


种不同分子量的多糖组分进行分析。将图2中峰 = 1 \* ROMAN I组分截留,截留产物一部分直接以带NaCl盐离子的状态上HPLC进行分析,结果见图4A;截留产物另一部分进行透析除盐处理,并将产物冷冻干燥后上HPLC进行分析,结果见图4B。实验结果表明分子量较大的峰 = 1 \* ROMAN I组分在有盐分存在的情况下呈现出单一的分子量较小的糖峰,但在脱盐处理后却呈现出分子量大小不同的三个峰。

B

 

A

 

图4 Ⅰ峰未脱盐与脱盐后的HPLC鉴定

Fig.4 HPLC elution of not desalination and desalination of Ⅰpeak

将图2中峰Ⅱ组分截留,截留产物一部分直接以带NaCl盐离子的状态上HPLC进行分析,结果见图5A;截留产物另一部分进行透析除盐处理,并将产物冷冻干燥后上HPLC进行分析,结果见图5B。实验结果表明分子量较小的峰Ⅱ组分在有盐分存在的情况下呈现出单一分子量较小的糖峰,但在脱盐处理后却呈现出分子量大小不同的几个峰。

B

 

A

 

 

 

   图5 Ⅱ峰未脱盐与脱盐后的HPLC鉴定

  Fig.5 HPLC elution of not desalination and desalination of Ⅱpeak

综合图4和图5图谱结果分析,SUGP在没有盐离子的存在情况下,出现分子量大小不同的多个糖峰,说明小部分SUGP发生聚集现象,形成分子量较大的多糖聚合体,而大部分SUGP仍保留游离的单体形式存在;而SUGP在盐溶液状态下只出现一个分子量较小的峰,说明盐离子阻碍了SUGP聚集现象的发生。SUGP的DEAE-52洗脱结果发现SUGP仅出现一个多糖峰,在初始洗脱条件下即被洗脱流出,SUGP应该为带有正电荷的多糖。部分SUGP多糖分子之间可能以离子键聚合成大分子量的多糖聚合物。而加入NaCl之后破坏了分子间的次级键,SUGP多糖分子之间不能聚合。经过Sepharose CL-6B纯化得到的SUGP (Ⅱ峰)是一种具有聚合能力的多糖。测定SUGP的相对分子质量为4436Da,SUGP(Ⅱ峰)可以聚合成分子量很大的聚合多糖,为多聚体而非寡聚体。

2.4 PMP柱前衍生化高效液相色谱法分析  SUGP单糖组成

 

葡萄糖

 

氨基葡萄糖

 

甘露糖

 

图6 SUGP的PMP水解衍生物色谱分离图 

  Fig.6 Chromatograms of PMP derivative of hydrolysate of SUGP

为检测SUGP是否为带有电荷的多糖,我们对SUGP的单糖组成进行了检测,采用PMP衍生化法对SUGP进行单糖组成的分


析,以反相C18色谱柱检测衍生化产物,结果见图6。图中显示在保留时间12.929、17.592、30.072min出现几个较明显的洗脱峰。对照标准单糖图谱保留时间可以判断,此三个峰依次为甘露糖、氨基葡萄糖和葡萄糖的洗脱组分。结果表明经过PMP-HPLC法测得SUGP的单糖组成为:甘露糖、氨基葡萄糖、葡萄糖。氨基葡萄糖是在水溶液中可以带正电荷的单糖,因此赋予SUGP在溶液状态下以带正电荷的形态,而这导致了SUGP可以聚集成多聚体。

3 结论

海胆生殖腺多糖SUGP是一种带正电荷的多糖,其相对分子质量为4436Da。PMP柱前衍生化高效液相色谱法测得SUGP的单糖组成为:甘露糖、氨基葡萄糖、葡萄糖。SUGP在氯化钠盐溶液中可以有效保持单体状态存在,但在脱盐并冷冻干燥后再溶解后小部分SUGP易发生聚合现象,为多聚体聚合形式,但仍有大部分SUGP保持单体状态存在,说明具电荷多糖在盐溶液中可以有效避免多糖聚集现象的发生。

参考文献:

[1] 王冬,王政乾,田红.海胆的研究进展及其应用     现状[J]. 中国海洋药物杂志,2006,25(4):52-54.

[2] 陆江海,李瑞声,张维汉.海胆化学和药理学研究概况[J].中国海洋药物杂志,1994(2):38-45.

[3] Kenichi Yoshino,Toshifumi Takao,Masahiko Suhara, et al. Identification of a novel amino acid, o-bromo-L-phenylalanine,inegg-associated peptedes that activate spermatozoa[J]. Biochemistry, 1991, 30(25): 6203-6209.

[4] 高翼,奚涛,刘纯慧,等.海胆壳蛋白的分离纯化及抗肿瘤活性[J] .中国天然药物,2006,6(4):464-467.

[5] Nair MSR, Mathur A, Tabei K, et al. Isolation and structure determination of two new bioactive lipids from the gonads of a sea urchin, Stronglyo-centrotus droebachiensis[J]. Journal of Natural Products, 1988, 51(1): 184.

[6] Takada N, Masami W. Isolation and structures of hedathiosulfonic acids , novel thiosulfonic acids from the deep-saa urchin Echinocardium cordatum[J].TetrahedronLetters,2001,42:6557-6560.

[7] Sheean P D, Hodges L D, Kalafatis N, et al. Bioactivity of extracts from gonadal tissue of the edible Australian purple sea urchin Heliocidaris erythrogramma [J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2007, 87(4): 694-701.

[8] 王小梅,孙润广,张静,等.两种方法提取的麦冬多糖结构及聚集行为的比较研究[J].电子显微学报,2013,32(1):54-60.

[9] 刘纯慧,奚涛,林亲雄,等.海胆黄多糖的分离、纯化及免疫活性测定[J] . 中国海洋药物杂志,2006,25(3):7-11.

[10] 张忠玲,刘亚民,韩金祥,等.海胆肠提取物的抗肿瘤作用[J] . 肿瘤研究与临床,2002,14(5):302-304.

[11] 曹宁宁,俞耀庭,陈长治.疏水性多糖的合成及荧光法研究其在水中的自聚集行为[J].离子交换与吸附,2000,16(3):252-257.

[12] 李晓钡.阿拉伯半乳聚糖蛋白分子的自聚集行为及其对单壁碳纳米管分散的研究[J].上海交通大学博士学位论文,2010.

[13] 李岱,张静,等. 酸性柴胡多糖WBP011的热特性及其聚集体特性的研究[J] .电子显微学报,2009,28 (3)260- 265.

[14 ] hunhui Liu, Qinxiong Lin, Yi Gao, Liang Ye, et al. Characterization and antitumor activity of  a polysaccharide from Strongylocentrotus nudus eggs[J]. Carbohydrate Polymers, 2007, 67: 313-318.

[15] 戴军,朱松,等.PMP柱前衍生高效液相色谱法分析杜氏盐藻多糖的单糖组成[J] . 分析测试学报,2007,26(2):206-210.

 

 

 

 

 

 

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